Bibliotecas de genes ou bibliotecas genómicas

Uma biblioteca de genes é uma colecção de fragmentos de DNA de uma determinada espécie de organismo que são clonados após terem sido inseridos num hospedeiro. 

Pode ser conseguida através da produção de DNA recombinante ou DNA complementar.

É suposto que uma biblioteca seja representativa de todos os genes do organismo, sendo muito útil quando se pretende isolar um gene específico. Assim, torna-se claro que quando se quer clonar um determinado gene ou o cDNA das mensagens por ele codificadas (mRNA) é necessário a construção de colecções de genes recombinantes. Se estes forem obtidos a partir do DNA genómico, sendo portadores de moléculas representantes de todo o genoma, constituem uma biblioteca genómica; uma biblioteca de cDNA é uma colecção de clones de DNA complementar. 

Uma biblioteca de genes pode ser uma colónia de bactérias ou placas de fagos com DNA recombinante. Esta inclui sequências de um conjunto muito grande, como o genoma inteiro de um organismo, sequências expressas de um tipo celular particular ou sequências presentes num fragmento de DNA.

Vantagens: 

A existência destas bibliotecas permite acelerar os processos laboratoriais, uma vez que os genes armazenados ficam disponíveis para posteriores utilizações, evitando desta forma as primeiras etapas do processo de isolamento de genes.

Técnica do DNA complementar - cDNA

O DNA é obtido a partir de uma molécula de mRNA.

Esta técnica é utilizada para quando se pretende clonar genes sem os seus intrões, pois o cDNA é produzido a partir de uma molécula de mRNA maturado (que já sofreu processamento e que por isso não possui intrões).

o cDNA utiliza-se também em conjunto com a técnica do rDNA.

A enzima transcriptase reversa usa a molécula de mRNA maduro como molde para fazer uma cadeia de DNA.

Após a formação da cadeia de DNA, a enzima DNA polimerase actua, formando, por complementaridade, a outra cadeia de DNA a partir dos nucleótidos presentes no meio, constituindo-se uma molécula estável (entretanto o mRNA degradou-se por ser instável). 

De seguida insere-se no vector.

Importância do cDNA:

As bactérias utilizadas, por exemplo, na técnica do DNA recombinante, por serem seres procariontes, não têm mecanismos de maturação do DNA e, desta forma, quando se incorporam genes com intrões nestes seres, eles executam a sua transcrição ininterruptamente, incluindo os intrões, gerando uma proteína diferente da desejada. Assim, é inserido um clone de cDNA, de modo a garantir a produção correcta da proteína.

Para além disto, a comparação entre a molécula de cDNA, que não possui intrões, com a molécula de DNA original permite localizar os exões, ou seja, as regiões que verdadeiramente contribuem para a produção da proteína, e os intrões, ou seja, as regiões não codificantes de um determinado gene.

É importante referir ainda que a descoberta da transcriptase reversa e do seu mecanismo de acção e, consequentemente, da tecnologia do cDNA, abriu um importante caminho na biologia molecular. A molécula de RNA é extremamente instável e, dependendo do RNA em questão, o número de cópias pode estar muito limitado. Desta forma, a possibilidade de se trabalhar com cDNA ao invés de RNA tem facilitado muito o trabalho dos cientistas, já que o cDNA é uma molécula estável, de fácil manuseamento e a sua multiplicação é bastante simples.

Técnica do DNA recombinante - rDNA

Objectivo: produzir moléculas de DNA a partir da combinação de genes com diferentes proveniências.

Para produzir DNA recombinante:

1 – as enzimas de restrição cortam o DNA em fragmentos manipuláveis que contêm o gene pretendido;

2 – esses fragmentos obtidos são incorporados num vector* (transporte do fragmento de DNA para uma célula);

3 – para que o fragmento de DNA seja incorporado no vector é necessário que a mesma enzima de restrição, que tinha actuado no DNA, actue agora no vector – assim, as zonas cortadas conseguem-se complementar;

4 – as enzimas DNA ligases são as responsáveis pela ligação dos dois fragmentos de DNA – é produzida uma nova molécula estável;

5 – o vector recombinante é colocado junto às bactérias (célula hospedeira) para ser incorporado por elas, que em condições adequadas se dividem criando inúmeras cópias do gene aí inserido – clonagem;

6 – seleccionar as bactérias que incorporaram o vector;

7 – purificação – separar o composto de interesse dos outros que foram produzidos pelo metabolismo normal do hospedeiro

* vector: plasmídeos (pequenos fragmentos livres de DNA com forma circular que estão presentes em bactérias) ou bacteriófagos (virus que atacam bactérias)

Com o rDNA é possível introduzir um gene humano em bactérias para que estas produzam, em larga escala, uma determina proteína humana.

Aplicações da tecnologia de rDNA

Engenharia genética - Técnicas

O património genético pode ser manipulado pela engenharia genética.

Esta engenharia implica um vasto conjunto de técnicas de análise e manipulação do DNA in vitro (em laboratório), que foi desenvolvida a partir da década de 70 do século XX.

A engenharia genética baseia-se num conjunto de técnicas e ferramentas que permite a intervenção no genoma de um organismo construindo novos genomas por recombinação de segmentos genómicos de um ou de diferentes cromossomas.

Enzimas de restrição e enzimas DNA ligases

Cancro - método ABCDE para vigilância de sinais

A maior parte dos sinais são manchas de células pigmentadas (melanócitos) que vão aparecendo na pele.

Apenas um pequeno número é de nascença; a maioria vai surgindo com o tempo e com o crescimento, tendo um aumento durante a adolescência. Num adulto existem aproximadamente 25 sinais em todo o corpo. O número de manchas pigmentadas depende da hereditariedade do indivíduo, das exposições ao sol e de outros factores como por exemplo a gravidez. Um sinal irregular não é obrigatoriamente maligno, mas pode ter um maior risco de transformação maligna.

Um  melanoma maligno é uma proliferação de células pigmentadas atípicas. 

O melanoma pode desenvolver-se a partir de um simples sinal, mais frequentemente se for irregular. Noutros casos, o melanoma surge espontaneamente sobre a pele sã.  O número de melanomas diagnosticados tem aumentado de ano para ano. A sua detecção deverá ser numa fase inicial para impedir o aparecimento de metástases (aparecimento de células cancerígenas noutros orgãos), que comprometem o sucesso do tratamento.

Deve-se controlar os sinais e no caso de haver qualquer alteração suspeita consultar o dermatologista!!

Controlar os sinais através do método ABCDE

A - assimetria : presente ou ausente

B - bordo : contorno regular ou irregular

C - cor : uniforme ou várias cores

D - diâmetro : inferior ou superior a 6 mm

E - evolução : como se vai alterando?

Cancro - curiosidades

• O cancro é uma palavra derivada do grego "Karkinos".

• O cancro não é uma doença única, mas sim 200 doenças distintas, cada uma delas com as suas próprias causas, história e tratamento.

• Os estudos epidemiológicos indicam que os factores ambientais são importantes na causa da maioria dos cancros - de 80% a 90% dos cancros resultam de factores ambientais.

• Exposição excessiva ao sol aumenta o risco de cancro da pele.

• O cancro ocorre a qualquer idade porem é o mais frequente em pessoas de idade avançada.

• A cura do cancro é definida como ausência de tumor após o tratamento por um período de vida tão longo como o do aquele que não teve cancro.

• Com as novas tecnologias e tratamentos, os oncologistas hoje oferecem maior índice de cura respeitando a dignidade do ser humano, sua qualidade de vida e relacionamento familiar e social. 

• Os factores genéticos são responsáveis pelos 20% dos tumores malignos.

• Os dados mostram que os tumores malignos ocupam os primeiros lugares em todos os países, e a tendência é de aumentar nas faixas etárias.

• A taxa de mortalidade por cancro é maior entre mulheres do que entre homens em todos os países. Isto se explica pela alta incidência do cancro do colo do útero e mama.

Mutações - Mutações reais

Irei agora mostrar-vos alguns exemplos de mutações em humanos.

Disprosopia

Duplicação craniofacial é um distúrbio raro no qual o rosto da mesma pessoa é duplicado na sua cabeça.

A condição é causada por uma proteína responsável por determinar as características do rosto e seu excesso leva a um segundo rosto espelhado. Falta da proteína leva a características faciais pouco desenvolvidas.

Normalmente as crianças nascem já sem vida. Neste caso, a menina sobreviveu por dois meses até ter uma paragem cardíaca.

Fetus is fetu

Um gémeo malformado é encontrado dentro do corpo de um gémeo hospedeiro, seja este uma criança ou um adulto vivo.

O que acontece é que os gémeos não se chegam a separar completamente quando são zigotos e ficam unidos por alguma região do corpo. Um dos gémeos irá crescer "normalmente" enquanto o outro fica atrofiado dentro do corpo do irmão e passa a depender completamente dele.

Quando o feto hospedeiro consegue sobreviver, este fica com uma saliência, como se fosse um inchaço na região onde está o feto.

Apenas será considerada como fetus in fetu caso haja um tronco e membros reconhecidos.

Muitas vezes estes casos passam despercebidos sem serem diagnosticados. 

Fibrodisplasia Ossificante Progressiva (FOP)

 

Doença muito rara que faz com que partes do corpo como os músculos, tensões e ligamentos se transformem em ossos quando são danificados. Assim as articulações fundem-se evitando o movimento. A remoção é ineficaz pois voltam a crescer novamente.

Não existe cura. 

O caso mais famoso é o de Harry Eastlack que teve o corpo tão ossificado que ao final da vida movia apenas os lábios.

Epidermodisplasia Verruciforme

Formação de verrugas na pele que nunca param de crescer.

Afecta principalmente os pés e as mãos. Se elas forem extraídas por cirurgia voltarão a crescer.

Na imagem ao lado aparece um senhor indiano que tinha quase seis quilos de verrugas. Elas foram removidas mas como era esperado voltaram a crescer e este necessita agora de uma nova cirurgia para usar as próprias mãos.